免 疫 学 实 验

实验一 与免疫相关的细胞形态的观察

目的要求：

观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。

实验器材：

显微镜

血液涂片（瑞氏染色）

结缔组织切片

方法：

油镜观察

一．血涂片的观察

（A）    红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。

（B）     颗粒白血球

嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。直径10—12微米。

嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径10—15微米。

嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。直径10—11微米。

（C）    无颗粒白血球

淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。其中含致密的核，染成深紫色。周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。6-8微米。

单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。

二．肥大细胞的观察（示教）

胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。其中含肝素、组织胺等物质。常成群地分布于血管的周围。

三．浆细胞的观察（示教）

细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。

四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。

附：

瑞特氏染色：

1．染色液配置

称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。贮褐色瓶中备用。（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。）

2．瑞特氏染色法：

取小鼠骨动脉血，涂制玻片。干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限制染液流掉）。于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。

                          

 

实验二   沉淀反应

可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（Precipitation）.由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。

为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。

沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。

（一）环状沉淀反应

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。

材料：

1.         免疫血清：免疫兔抗人血清

2.         抗原：人血清

3.         小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。

方法：

1.         取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。

2.         以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。

3.         用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。

4.         置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。

 

（二）.琼脂扩散试验

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。

抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试验。

（1）          单向琼脂扩散试验

材料：

1．诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）

2．待检血清（抗原）：人血清

3．参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。

4．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。

方法：

1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。

2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。

图1单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图

1-5孔加参考血清，6-7孔加待检血清

 

3．向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。

4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。

5．测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。

（2）          双向琼脂扩散试验

材料：

1．诊断血清：兔抗人血清

2．待测血清：人血清

3．阴性对照血清

4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。

方法：

1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。

2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。

图2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图

3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。

6．结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。

①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。

图3 双扩散试验结果示意图

A：已知抗体  a、b：阳性对照

c、d、e、f：被检材料

②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。

                 图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系

                   a、b：抗体  A、A’、B：抗原

                   A、B完全不同 A、A’部分相同

                  

 

③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。

④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。

⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。

⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。

（三）对流免疫电泳试验

       对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。

 材料：

1．诊断血清：免抗人免疫血清

2．待检血清：人血清

3．阴性对照血清

4．PH8.6,离子强度0.05M的巴比妥缓冲液配置

               巴比妥钠     10.3克

               巴比妥       1.84克

               蒸馏水       1000毫升

5．缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用PH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05M的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。

6．电泳仪

7．其他：生理盐水、打孔器、微量进样器。

方法：

1．琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散试验。

2．加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。

图5 对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图

3．电泳

用国产普通电泳仪。其内加0.05mPH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2—4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2—3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。电压为4—6伏/厘米。通电45分钟—2小时后观察结果。

4．结果观察：在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

5．影响结果的因素

（1）     抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2）     几组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差。

（3）     电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择每厘米5毫升，电泳时间改为1.5小时。

（四）免疫电泳实验

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。

材料：

1．待检标本（抗原）：正常人血清。

2．抗体：正常人血清的家兔免疫血清。

3．1.5%离子琼脂（系用巴比妥缓冲液配制的）

4．电泳仪

5．巴比妥缓冲液：

巴比妥1.84克

巴比妥钠10.3克

蒸馏水1000毫升

pH8.6，离子强度（M）0.05

6．其它：载物玻片，直径3毫米打孔器，20mmⅹ2mm玻璃铸型，微量进样器。

方法：

1.取载物玻片（7.5ⅹ2.5厘米）加上3.5毫升1.5%琼脂凝胶，制成2毫米厚的琼脂板。

2.按图位置，在琼脂板未凝固时，放入抗血清槽铸型，注意勿使铸型全部浸入琼脂中，待凝固时再打孔。

3.加待检标本：用微量进样器往孔中加1—5微升。

4.电泳：电压9—7伏/厘米，泳动15—20小时。

5.电泳后取出抗血清槽铸型，加入抗血清，进行双扩散，一般在24小时内沉淀弧出全。

6．观察结果：或描绘、拍照或进行染色，染色后的标本便于结果分析及保存。

               图6 免疫电泳抗原孔和抗体槽位置示意图

（五）火箭电泳试验

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。

材料：

1．诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清

2．待检血清（抗原）：人血清

3．参考血清

4．pH8.6，离子强度0.05M巴比妥缓冲液配制（见对流免疫电泳试验）

5．其它：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪

方法：

1．抗体琼脂板的制备

同单向扩散法，但注意稀释液应用pH8.6离子强度0.05M的巴比妥缓冲液。

2．打孔见下图

 

 

 

 

                   图7 火箭电泳抗原孔位置图

3．将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原（人血清）分别加入各孔中，每孔10或20微升，要求加量准确而不外溢。

4．把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压4—6伏/厘米，电泳时间1—5小时，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火箭状沉淀线，关闭电源。

5．取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线的高度。同单向琼脂扩散法绘制标准曲线，查出待检血清中Ig含量。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验三   凝集反应

当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时，在有一定浓度的电解质环境中，抗原凝集成大小不等的凝集块，叫做凝集反应。

凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。

一．直接凝集反应

颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应。

（一）玻片凝集反应

材料：

1．诊断血清：1：10稀释的伤寒杆菌诊断血清

2．菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物

3．生理盐水、载玻片、毛细吸管

方法：

1．取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1：10稀释伤寒杆菌诊断血清1-2滴，第三格加1-2滴生理盐水。

2．无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。

3．同法取枯草杆菌培养物少许，于第二格内混匀。

4．轻轻摇动玻片，经1-2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。

（二）试管凝集反应

 为一种定量试验，用已知抗原检查血清中有无特异抗体，并测定其相对含量。

 材料：

1．诊断血清1：10稀释伤寒杆菌“H”血清，1：10稀释伤寒杆菌“O”血清。

2．菌液：伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O” 菌液。

3．生理盐水，小试管，吸管。

方法：

1．取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5毫升生理盐水。

2．在第1排1管中加入1：10稀释伤寒H血清0.5毫升，于管内连续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5毫升注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5毫升注入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5毫升弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数为1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作为对照。

3．同法用吸管吸取1：10稀释伤寒杆菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。

4．用移液管吸取伤寒杆菌H菌液，加收第1排各管中每管0.5毫升（由盐水对照管开始，依次由后向前加入）此时血清稀释倍数又增加了一倍。

5．同法于第2排各管中加入伤寒O菌液0.5毫升。

6．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2—4小时或37℃孵育箱中过夜次日取出观察结果。

观察结果：

1．观察切勿摇动试管，以免凝集块分散。

2．先看对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。

3．试验管应自第1管看起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下：

“++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；

“+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管‍底；

“++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；

“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；

“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。

4．轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾状上升，随即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底轻摇即升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。

5．记录观察的结果并制定凝集效价。通常以能产生明显凝集（++）的血清大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第1管1：40）仍无凝集应报告为低于1：40。如血清的最高稀释度（即第6管1：1280）仍显完全凝集现象。，应报该血清效价高于1：1280。

二．间接凝集反应

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。

（一）间接血球凝集试验

间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝集现象。

间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。

材料：

1．抗原—伤寒杆菌O抗原

2．免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清

3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等

方法：

1．“O”抗原的制备：

将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。

2．致敏红血球悬液制备：

取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。

3．试验步骤：

（1）小试管9只标好号码于试管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理盐水，其余各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。

（4）于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中呈现完全血凝者，即为该血清的间接血清效价。

（二）间接凝集抑制试验

若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。

妊娠试验：

孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入胶乳抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳胶颗粒）。不发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗体消耗，当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒，妊娠试验为阴性。

 

材料：

1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清

3．被检材料：孕妇尿

4．正常尿作对照用

5．黑反应板1块

6．滴管3只

方法：

1．用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿。

2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。

3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动3—5分钟，在较强光线下，观察结果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应，怀孕。

注意事项：

1．试验材料用具用前使温度接近室温（20℃左右）

2．被检尿太混浊，需要小心过滤。

3．尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。

（三）协同凝集试验

金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白能与人及多种哺乳动物（猪、兔、羊、鼠等）血清中IgG类抗体 的Fc段结合。IgG的Fe段与SpA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其与特异性抗原相遇时，也出现特异凝集现象。在以凝集反应中，金黄色葡萄球菌菌体成了IgG抗体的载体,称为协同凝集反应.本反应也可用于检测微量抗原.

A.      材料：

1.       抗原:可溶性伤寒杆菌O抗原

2.       免疫血清：伤寒杆菌0901免疫兔血清

3.       10%CoWan1株金黄色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液

4.       PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等

B.      方法：

1．10%葡萄球菌菌悬液的制备：CoWan1株葡萄球菌接种于柯氏瓶，37℃培养18-24小时，用PBS洗下菌苔，每分钟2500转速度离心20分钟。沉淀菌用PBS洗两次后，用0.5%甲醛（用PBS配置）在室温中固定3小时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

2．致敏葡萄球菌：

 1毫升10%的菌悬液加0.1毫升伤寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分钟（中间需摇动两次）。取出后经每分钟2500转速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀菌用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

3．协同凝集试验

取伤寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌悬液，一滴在载波片上混匀，观察约2分钟。一般在几秒钟内即可发生凝集。

 ‚滴一滴致敏葡萄球菌悬液于玻片上，用接种环取伤寒O菌培养物少许置于悬液中使成均匀孔状，观察约2分钟，记录有无凝集。

ƒ用伤寒“O”杆菌培养物与未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾杆菌培养物与致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均为阴性反应，不出现凝集。

三．凝集吸收

肠道杆菌中的许多细菌都有部分相同的抗原结构。因之一种细菌可与另一种细菌相应的抗血清发生交叉凝集反应。用一种过量的细菌抗原与发生交叉凝集反应的抗血清相结合。可将其共同抗体吸去，剩下抗体只能与特异性抗原起反应，这种试验即称凝集吸收试验。

利用凝集吸收试验可制备单价因子血清，以进行细菌抗原结构的分析及鉴定菌型。

材料：

1.       免疫血清：1：10稀释伤寒杆菌免疫血清。

2.       菌液：肠炎杆菌菌液，伤寒杆菌菌液。

3.       试管、吸管、毛细吸管。

方法：

1.      1/10稀释伤寒杆菌免疫血清分别与肠炎杆菌与伤寒杆菌进行玻片凝集，可见伤寒免疫血清与两种菌均有凝集，说明二菌具有共同抗原结构，故发生交叉凝集反应。

2.      将一定量的肠炎杆菌菌液加入1：10稀释伤寒杆菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小时，取出后离心沉淀，吸取上清夜，弃去沉淀。

3.      将吸收过的上清夜与稀释肠炎杆菌菌液做玻片凝集，观察结果。如仍有凝集时则将此上清夜再加浓肠炎杆菌菌液进行吸收，方法如上。

4.      重复吸收过的上清夜分别与稀释肠炎杆菌及伤寒杆菌菌液进行玻片凝集。如与前者无凝集而与后者有凝集，则表示伤寒杆菌免疫血清中的抗肠炎抗体已被完全吸收。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验四    溶血反应和补体结合试验

一．溶血反应

免疫血清与其相应的抗原细胞（血球、细菌及其组织细胞相遇，并在补体的参与下可出现溶细胞反应。依抗原、抗体的种类不同可有溶血反应、溶菌反应等。

溶菌反应只在某些细菌中出现（如霍乱弧菌）。应用溶血反应是补体结合反应中不可少的因素。溶血反应是由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，并吸着了补体，而使红血球在补体的作用下被溶解，于是产生了溶血现象。

材料：

1.                 抗原：2%绵羊红血球。

2.                 抗体：溶血素

3.                 补体：取健康豚鼠血清作为补体。

4.                 小试管、生理盐水、水浴箱。

方法：

1．取小试管3只，按下表加入各物（容量单位为毫升）

试管	2%红血球	溶血素（2单位）	补体（2单位）	生理盐水	结果
1	0.5	0.5	0.5	0.5
2	0.4	0.5	——	1.0
3	0.5	——	0.5	1.0

2．将上述3试管放在37℃水浴箱内15—30分钟观察有无凝血现象。

 

 

 

二．补体结合反应

当抗原与其对应的抗体结合时，所生成的抗原抗体复合物能从溶液中将补体吸着此即谓补体结合。参与补体结合反应的抗原是透明的溶液，故补体结合现象不能被肉眼看出来，因此必须借助溶血系统（溶血素及相对应的羊血球）作为指示剂，来判定媒质中有无游离的补体，近而推定媒质中未知抗原（或抗体）和已知抗体（或抗原）是否进行了特异性的结合。本反应具有很高的敏感性及特异性，因之常应用于传染病的诊断，特别诊断病毒疾病和梅毒。

 由于参与本反应的各种成分间有着一定量的关系，因此在作本试验之前，必须通过一系列的预备实验来确定各成分的使用量，故本反应的实验方法较为复杂。

本次实验以伤寒杆菌免疫血清与其相对应的抗原补体结合试验为例。

材料：

1.     抗原：伤寒的抽出液

2.     抗体：伤寒杆菌的免疫血清

3.     补体：豚鼠血清

4.     溶血素：抗绵羊血细胞的兔血清

5.     2%绵羊红血球

6.     小试管、试管架、水浴锅。

方法：

（一）预备试验（示教说明）

预备试验包括溶血素效价的滴定，补体效价的滴定，抗原效价的滴定及被检血清的处理。

（1）     溶血素效价的滴定

按照下表加入各物

 

管号	溶血素（ml）	溶血素 稀释倍数	1：20 补体‍（ml）	生理 盐水‍（ml）	2%羊血球（ml）		假定结果
1	0.5	1：300	0.3	1.7	0.5	摇匀后置37‍℃水浴一小时	全溶解
2	0.5	1：500	0.3	1.7	0.5		全溶解
3	0.5	1：800	0.3	1.7	0.5		全溶解
4	0.5	1：1000	0.3	1.7	0.5		全溶解
5	0.5	1：1200	0.3	1.7	0.5		全溶解
6	0.5	1：1600	0.3	1.7	0.5		全溶解
7	0.5	1：2000	0.3	1.7	0.5		全溶解
8	0.5	1：2400	0.3	1.7	0.5		全溶解
9	0.5	1：3200	0.3	1.7	0.5		全溶解
10	0.5	1：4000	0.3	1.7	0.5
11	0.5	1：4800	0.3	1.7	0.5
12	0.5	1：6000	0.3	1.7	0.5
对照		1	0.3	2.2	0.5

 

凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。依上表结果第10管（即1：4000倍稀释）0.5毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.5毫升中含有2个溶血素单位的溶液，所以试验时应取1：2000倍稀释的溶液。

（2）     补体单位滴定

依下表加入各试剂：

管 号	补体 (1：20)（ml）	抗原 (ml）	生理盐水(ml）	置 于 37‍ ℃ 水 浴 45 分钟	溶血素 (2单位）（ml）	2%羊血球悬液（ml）	置 于 37 ‍℃ 水 浴 15 分钟	结果
1	0.20	0.5	1.30		0.5	0.5		不溶血
2	0.25	0.5	1.25		0.5	0.5		稍溶血
3	0.30	0.5	1.20		0.5	0.5		全溶血
4	0.35	0.5	1.15		0.5	0.5		全溶血
5	0.40	0.5	1.10		0.5	0.5		全溶血
6	0.45	0.5	1.05		0.5	0.5		全溶血
7	0.50	0.5	1.00		0.5	0.5		全溶血
8	-	0.5	1.50		0.5	0.5		不溶血

能引起完全溶血的最小补体量称为准确单位，上表中第3管（即0.3毫升），但因补体的效价可能有部分损失，故普通稍高的一管为实用单位，实际试验时须用两个实用单位。

上表的结果为：

补体标准单位：0.3毫升

补体实用单位：0.35毫升

补体两个实用单位：0.70毫升

因试验时是两个实用单位的补体0.5毫升，可依下列比例关系换算：

20：0.7=ⅹ：0.5

ⅹ= 14.3

即须将补体稀释14.3倍，用0.5毫升则含有两个实用单位。

（3）     抗原的滴定

在用已知抗原测定未知抗体时，必须先滴定抗原效价以决定本试验时所需抗原的最适浓度（反之用已知抗体测定未知抗原时，则需滴定抗体效价）

试        管号 剂	1	2	3	4	5	6
1：5稀释血清	0.5	0.5	0.5	－	－	－
伤寒抗原2U	0.5	－	－	0.5	－	－
痢疾抗原1：80	－	0.5	－	－	－	－
补体2U	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
生理盐水	－	－	0.5	0.5	1.0	1.5
摇匀放置37℃水浴中30min
溶血素2U	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	－
2％羊血球	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
摇匀放置37℃水浴中15min
说明	试验管	特异性对照	血清 对照	抗原 对照	溶血素对照	羊血球对照

 

如血清对照管呈完全或部分不溶血是为抗补体现象。血清严重污染细菌，混有淋巴液或显著溶血时，常产生很强抗外体作用。又如试管、吸管不清洁，也可出现抗补体。若有抗补体发生，应抽血重试验。

                      

 

 

 

 

实验五  T、B淋巴细胞分离试验

淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的    AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。

材料及试剂：

a)         新鲜豚鼠血

b)         兔红细胞（RRBC）

c)         溴花二氨基异硫氢化物（AET）

d)         淋巴细胞分层液

e)         其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。

方法：

1.     AET—RRBC制备

（1）. AET溶液的制备

称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。

（2）. AET处理RRBC

取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。

（3）.1%AET—RRBC的配制：

将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。

2.     从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。

3.     AET—E花环试验：

将分离的单个核细胞（2ⅹ10⁶/毫升）与等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。

4.     T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离

将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。

 

 

 

 

 

实验六   豚鼠T淋巴细胞的测定

——兔红细胞玫瑰花环试验

玫瑰花环试验，又称为花结试验。是测定淋巴细胞数量和功能的一种方法。

人类T和B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于人类T淋巴细胞表面具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成E花环，因此，T细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。根据E—玫瑰花环形成率，可以间接判断机体细胞免疫力。目前，已广泛应用于临床，作为测定人群免疫状态的一个指标。

材料：

1.     肝素（100单位/毫升）

2.     0.5%兔红细胞悬液（用Hanks液配制）

3.     吸收过的胎牛血清：

取经56℃30分钟加热灭活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后，37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟，取上清液即成。

4.     Hanks液

5.     豚鼠抗凝血

6.     淋巴细胞分层液

7.     灭菌注射器，针头，试管，吸管等。

方法：

1.          淋巴细胞提取

（1）             取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。

（2）           2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加5倍体积的Hanks液洗1—2次，（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。

图8 用分层液离心后的血细胞层

 

2.          加吸收过的胎牛血清0.1毫升，0.5%兔红细胞悬液0.2毫升，于淋巴细胞中。混合后，37℃水浴5分钟。

3.          500转/分离心5分钟，放4℃冰箱中2小时后，弃大部分上清。

4.          染色及观察

轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美兰液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加盖玻片镜检。

高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞，凡结合3个或3个以上的兔红细胞者为阳性，计算花环形成细胞的百分率。

 

 

实验七  酶联免疫吸附试验

（ELISA）测定伤寒杆菌“O”抗体

酶联免疫吸附试验是用酶标记的抗体（或SPA）检测未知抗原或抗体的方法。此法敏感性高，特异性强。常用的是ELISA方法，间接法，双抗体法和抗原法。本次试验介绍，酶联葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，见图9

图9 ELISA－SPA法原理

1.          加抗原 使之吸附于固相载体（如塑料反应板）

2.          洗涤 加待测血清

3.          洗涤 加酶标记SpA

4.          洗涤 加酶的底物。经酶的催化产生有色产物。

材料：

1.          聚乙烯塑料反应板（PH9.6时可吸附蛋白Ag）

2.          抗原：伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原

3.          待测血清

4.          冻干酶联葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）纯品

5.          邻苯二胺（OPD）

6.          包被液：0.05M碳酸钠—碳酸氢钠溶液PH9.6

7.          稀释液：10%免疫血清PBS—吐温20，防止非特异性吸附

8.          洗涤液：0.02MTrisTWeen20 ,Ph7.4防止非特异性吸附

9.          底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升

              0.1M柠檬酸24.3毫升

蒸馏水50毫升

临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。

10.       终止液；2M硫酸

方法：

1．抗原包被

取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小时，弃抗原液，用洗涤液3次每次3分钟。

2．加待测血清

于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。置37℃30分钟，洗涤3次。

3．加酶联A蛋白

于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升，置37℃20分钟，洗涤3次。

4．加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处15分钟。加2M碳酸1滴终止反应。

5.结果判断：（肉眼判断）

若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表示。

综合设计性实验

实验一 抗体产生细胞的检测——溶血空斑实验

（综合性实验）

取绵羊细胞免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与一定量的指示细胞（绵羊细胞）和补体结合，注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的抗体形成释放抗体，抗体与周围的绵羊红细胞（抗原）结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推算脾内存在的抗体产生细胞总数。

材料：

1.  20—22克健康小鼠

2.  解剖器械

3.  注射器，平皿，漏斗，纱布，研钵

4.  20%绵羊红细胞悬液

5.  洁净脱脂载玻片（75ⅹ25毫米），盖玻片（22ⅹ22毫米）。

6.  Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7.  微量加样器

8.  指示细胞悬液，配制方法如下：

10%绵羊红细胞  0.5毫升

补体（新鲜豚鼠血清）0.5毫升

含5%小牛血清的Hanks液  2毫升     混合后水浴备用

方法：

1．免疫动物

取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中

2．脾细胞液的制备

（1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1—2次。

（2）取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4—8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。

如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。

（3）沉淀细胞用Hanks液洗1—2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。

（4）取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。

*脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。

3．玻片小室的制作

取洁净（无油）的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。

                图10玻片小室示意图

4．细胞混合液的配制

取小试管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。

5．混合细胞的灌注

用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70ul）

每个样品注2个小室，取其平均值。

6．用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。

7．将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟

8．溶血空斑计数

肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。

全脾脏中抗体产生细胞总数可依下述公式计算：