题目：Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis
期刊：Molecular Cell
影响因子：14.248
主要技术：RNA-Seq、CRISPR/Cas9、circRNA FISH
研究背景
环状RNAs（circRNAs）是一个具有独特结构的转录子家族，其大部分功能仍然是未知的。近几年在探究circRNA的成环机制和调控机制中，越来越多的证据证明其在人类疾病中的潜在作用，且很大程度上与生物进程相关。
在本项研究中，作者发现circRNAs调控了小鼠和人类肌肉分化过程，且其表达量在杜氏肌营养不良（DMD）成肌细胞中发生改变。通过特定的基因敲除策略和高含量的表型筛选，初步确定circ-ZNF609参与控制肌生成的过程，并根据肌细胞增殖的调节能力，进一步发现与circRNA翻译过程相关。
研究内容及结果
1. circRNAs在分化的哺乳动物成肌细胞中含量丰富、相对保守和高表达
本文采用在生长培养基（GM）中培养或诱导分化为肌管的人类和小鼠成肌细胞，提取总RNA后进行末端核糖核酸酶RNA序列分析（RNA-Seq），并通过FindCirc软件检测出circRNAs，结合qRT-PCR验证RNA序列数据。数据显示，在人类和小鼠样本中均发现数千个环状剪接事件，通过基因组的注释和编码区域的结构注释发现，几乎有90%来自于编码蛋白质的基因内外显子（图1B），近10% circRNAs相对于线性RNA呈现出高度表达状态。韦恩图显示出在人类和小鼠中分别鉴定的2100和1600种环状RNA，且其中均有近600种是保守的（图1C）。在样本信息中筛选高水平表达的人类环状物时（超过5次读取），与小鼠环状物的重叠性从25%增加到40%，可以读出人类的基因组与小鼠存在同生性的区域重叠（图1D）。
图1 在分化的哺乳动物成肌细胞中鉴定circRNAs
2. 肌肉分化及疾病样本中circRNA的表达差异
通过选择肌肉分化和肌肉疾病的样本，来定量分析circRNA的表达情况和调节机制。如图2A-2B所示，散点图显示了肌母细胞（GM）和肌管（DM）在高表达circRNA中的读取映射，结合热图中正常样本（WT）和杜氏肌营养不良疾病样本(DMD)的circRNA表达水平，发现了在不同细胞中circRNA表达水平不一。同样，在相同基因组坐标下线性和环性读取比率也遵循类似趋势（图2C-2D），可能与RNA分子稳定性有关。根据Cuffdiff计算FPKMs后的数据统计条形图得知，相对于下调和非差异基因，上调基因明显地诱导circRNA表达（图2E-2F）。从circ-BNC2和circ-CDYL基因座的覆盖图来看，circ-CDYL可能是由于基因座的转录而被激活，且在肌细胞生成过程中环状和线性的读取同时增加。
图2 在人类成肌细胞分化与疾病中circRNA差异性表达
3. 人类肌细胞的circRNA的基因敲除和表型筛选
首先基于RNAi进行circRNA功能筛选，针对29个circRNA来设计两个小干扰RNA（siRNAs）。图3A中的示意图显示表型筛选策略的实验工作流程；图3B中热图显示两个siRNAs 都抑制成肌细胞分化（每列表示一个表型，每行表示一个样本）。对两种常见的肌生成标记物（肌生成素、肌球蛋白重链）进行免疫荧光分析及DAPI染色，采用对照干扰siRNAs（si-SCR）、对抗circ-QKI的siRNAs (si-QKI #1) 和circ-BNC2 (si-BNC2 #1)分别诱导分化48h和96h，可观察到表型变化与BNC2基因敲除相关。与此同时，结合qRT-PCR验证，可推测在肌细胞分化开始时circ-BNC2可能与抗肌源性BNC2- mRNA产生竞争机制（图3C-3D）。
图3 人类肌细胞的circRNA的基因敲除和表型筛选
4. circ-ZNF609调控成肌细胞的增殖
在补充实验中，通过溴脱氧尿苷标记分析成肌细胞中一组高表达circRNA与细胞增殖能力之间的关系。分别采用对照干扰siRNAs（si-SCR）和一系列对抗的siRNAs 治疗人类成肌细胞，发现circ-ZNF609（siRNA #1）敲除组的BrdU荧光值显著地下降了80%（图4A）。图4B显示circ-ZNF609表型验证的siRNAs技术流程，发现circ-ZNF609敲除后细胞增殖标志物（CDK1和细胞周期蛋白A2）均显著性降低，与此同时在小鼠成肌细胞中也观察到类似的现象（图4C）。另外，通过比较三种不同siRNAs（si-circ，si-ex2，si-mRNA）活性来验证初始筛选，荧光值显示si-circ和si-ex2组成肌细胞的生长率降低了80%，而si-mRNa仅针对线性mRNA而不影响增殖（图4C-4D）。采用qRT-PCR分析ZNF609 RNA（周期进展标志物CDK1和Cyclin A2）表达水平来确认三种siRNA的特异性（图4E），进一步说明表型变化具有非靶向效应而增殖能力受circRNA活性影响。设计探针进行Northern Blot分析，发现circ-ZNF609对si-circ治疗敏感和RNase R耐药，但ZNF609 mRNA刚好与之相反（图4F）。有趣的是，qRT-RCR检测发现在控制成肌细胞的肌生成过程中，circ-ZNF609表达量在WT组中下调而在DMD组中上调，这些数据进一步加强了circ-ZNF609与成肌细胞增殖的联系。
图4 circ-ZNF609调控成肌细胞的增殖
5. circ-ZNF609编码过程与多聚体有关
从图5A来看，circ-ZNF609来源于宿主基因第二外显子的环化，其内含一个753 nt的开放阅读框（ORF），包含转录起始位点和终止密码子（图5A）。为了确定功能性，作者采用蔗糖梯度分馏测试circ-ZNF609在多聚体上的负载，并结合qRT-RCR分析得到没有ORF 的circRNA（circ-PMS1）停留在游离RNA组分上，circ-ZNF609沉淀在多组分中，且后者的沉积模式是由主动翻译引起的。另外在补充实验中，核糖核酸酶R抗性结果证实了多聚体结合的circ-ZNF609 RNA发生环状构象。
图5 circ-ZNF609 RNA与多聚体有关
6. circ-znf609具有蛋白质编码活性
如图6A（P-Circ3XF结构的示意图）所示，构建循环转录的表达载体测试circ-ZNF609的蛋白编码能力。对编码蛋白进行滴定检测，结合WB检测分析（图6B）得到环状模板产生的两种亚型数量大致相同，但线性模板的翻译强烈偏向于第一个ATG。为了进一步证明染色体基因circ-ZNF609 RNA 的蛋白质编码能力，如图6D所示，作者将33 FLAG编码序列插入内源性ZNF609，再通过质谱检测单个肽在蛋白质序列上的映射位置（图6E），最后确定circ-ZNF609编码蛋白质的过程。在正常或热休克条件下，用pcDNA或p-Circ3xf转染Hela细胞并对蛋白质的抗标记抗体进行WB分析，发现了热休克诱导的标记circ-ZNF609转录物被显著地增强了翻译过程（图6G）。设计双荧光素酶报告基因来测试circ-znf609是否具有IRES样活性，结果显示circ-znf609的UTR能够以一种依赖于拼接的方式进行IRES工作。
图6 circ-znf609具有蛋白质编码活性
文章小结
本文作者采用体外分化的小鼠和人类成肌细胞进行circRNAs表达谱分析，并鉴定了在肌发生过程中受到调控和在杜氏肌营养不良中发生改变的保守物种。高含量功能基因组筛选出与成肌细胞增殖特异性相关的circ-ZNF609，同时发现其以一种剪接依赖和帽独立的方式参与到真核生物的编码蛋白过程。通过CRISPR/Cas9基因编辑获得内源性标记等位基因的细胞系发现circRNAs的翻译活性低，有趣的是，热休克时标记circ-ZNF609翻译的显著激活，同时发现顺式作用元件通过一个与帽无关的机制应对不同的细胞应力去启动翻译。综上所述，文献中作者发现的circ-znf609为这类无帽和多聚腺苷尾转录物翻译所需的因子提供了相关材料，在未来仍然有必要进一步探究circRNA的功能机制。
解析文献
Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol Cell. 2017 Apr 6; 66(1): 22-37.