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NEPA21 电转染仪助力— 利用黄热病病毒复制子构建SARS-CoV-2 repRNA疫苗及其检测

作者:广州市艾贝泰生物科技有限公司 2023-06-05T10:58 (访问量:8875)

利用黄热病病毒复制子构建SARS-CoV-2

repRNA疫苗及其检测

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒病(COVID-19)大流行是一种全球性威胁。SARS-CoV-2的主要传播途径包括**、打喷嚏和呼吸道飞沫以及气溶胶等。症状轻的患者可在10天后康复,而严重者因肺泡损伤而出现间歇性呼吸衰竭导致死亡,因此为了预防大流行,开发安全有效的疫苗是极有必要的。

2022年,日本科学家在国际知名科学期刊PLOS ONE上发表了题为“Construction and evaluation of a selfreplicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon”的文章,该研究将编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的基因插入到黄热病病(YFV)毒株复制子中,构建并检测了一种repRNA疫苗,复制子RNA (repRNA)是一种安全、有效的疫苗,该疫苗不仅编码抗原基因,还编码RNA复制所需的基因并且自我复制,因此可以引起强大的免疫力。



在本研究中,作者在YFV复制子中构建了含有SARS-CoV-2 S)蛋白编码区的repRNA疫苗(图1A),同时也构建了non-repRNA疫苗(图1B)。

采用NEPA21电穿孔器(Nepagene)repRNAnon-repRNA疫苗电穿孔至幼鼠肾细胞(BHK)转染后48 小时,通过western blotting法证实S蛋白在BHK细胞中的表达,同时免疫荧光法证实S蛋白与YFV蛋白共表达。作者采用了Real-time RT-PCR验证repRNA疫苗在BHK细胞中的自我复制能力。然后对6周龄雌性C57BL/6小鼠分别于第0、28、56天经腹腔注射repRNA疫苗、non-repRNA疫苗各1μg,同时利用NEPA21电穿孔向小鼠大腿处提供电脉冲,增强RNA疫苗的递送。然后通过ELISA法检测了sars - cov - 2s的igg抗体以及YFV非结构蛋白1 (NS1)抗体水平。此外,作者制备了S蛋白假型荧光素酶报告慢病毒作为评价小鼠体液免疫的工具,为了验证YFV复制子骨干系统和体内RNA电穿孔免疫的充分性,构建了DENV含有包膜(E)基因的YFV复制子,并采用与SARS-CoV-2 repRNA疫苗基本相同的方法进行了评估。第三次接种后20天,从小鼠身上分离脾脏淋巴细胞。利用这些脾细胞,采用单色酶联免疫吸附斑点法(IMMUNOSPOT)进行酶联免疫吸附斑点(ELISpot)检测。

通过上述一系列实验,成功生成了一种编码repRNA疫苗的DNA质粒,该质粒在YFV复制子中含有S蛋白的外结构域(图1A)。western blotting法证实了repRNA和non-repRNA在细胞内表达S蛋白(图2A),但repRNA表达的S蛋白明显高于non-repRNA, non-repRNA几乎检测不到S蛋白(图2B)。此外,利用实时RT-PCR检测转染细胞中RNA水平的动力学,以探究repRNA疫苗的自我复制能力。在转染后24-96小时,与未转染repRNA疫苗的细胞相比,转染repRNA疫苗的细胞中RNA水平显著升高(图2D)。这些数据表明,repRNA疫苗构建成功且具有自我复制能力,证明了其疫苗效力。


1repRNAnon-repRNA疫苗的构建


图2、repRNA和non-repRNA疫苗的体外检测

为了进一步研究细胞免疫的诱导作用,在第三次免疫后20天采集接种SARS-CoV-2小鼠的脾细胞,并进行ELISpot检测。在实验模型中,repRNA疫苗的免疫水平虽然有限,但与non-repRNA疫苗相比,它在小鼠体内诱导了t细胞应答(图3)。


图3、repRNA和non-repRNA疫苗的体内检测


本实验中,研究人员借助NEPA21电转染仪卓越的基因导入功能完成了RNA疫苗导入到小鼠的肾细胞中,以及对小鼠进行腿部肌肉电转提高RNA疫苗的转染效果,为实验成功锦上添花。该研究证实所制备的repRNA疫苗能够在体外表达S蛋白并具有自我复制能力。该疫苗在小鼠体内并没有强有力地诱导体液免疫,可能是由于S蛋白表达较低,尽管如此,还是有对S蛋白产生特异性t细胞反应的倾向。同时在诱导t细胞活化程度方面,repRNA疫苗显著高于non-repRNA疫苗,证实了repRNA作为疫苗的有效性。然而,为了提高repRNA疫苗的免疫诱导能力,后续还需要进一步优化疫苗给药方式,提高S蛋白的表达。

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文献信息

(1)原文链接:

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274829

(2)参考文献:

1、Nakamura A, Kotaki T, Nagai Y, Takazawa S, Tokunaga K, et al. (2022) Construction and evaluation of a self-replicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon. PLOS ONE 17(10): e0274829.

2Li P, Luo Z, Liu P, Gao N, Zhang Y, Pan H, et al. Bioreducible alginate-poly(ethylenimine) nanogels as an antigen-delivery system robustly enhance vaccine-elicited humoral and cellular immune responses. J Control Release. 2013; 168: 271–279.

3Erasmus JH, Khandhar AP, O’Connor MA, Walls AC, Hemann EA, Murapa P, et al. An Alphavirus derived replicon RNA vaccine induces SARS-CoV-2 neutralizing antibody and T cell responses in mice and nonhuman primates. Sci Transl Med. 2020; 12: 9396.

4Long B, Carius BM, Chavez S, Liang SY, Brady WJ, Koyfman A, et al. Clinical update on COVID-19 for the emergency clinician: Presentation and evaluation. Am J Emerg Med. 2022; 54:46–57.

5、百度百科


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