简介
iFluor 染料是一系列优秀的荧光标记染料，可以覆盖整个可见光谱。所有iFluor 染料都具有优异的水溶性。它们的亲水性使有机溶剂的使用最小化。 iFluor 染料也具有比经典荧光标记染料更好的标记性能，如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7 。一些iFluor 染料在某些抗体上明显优于Alexa Fluor 标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸而不包含性能的最便宜的荧光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每种iFluor染料的开发都与特定的Alexa Fluor 或其他标记染料（如DyLight 染料）的光谱特性相匹配。
琥珀酰亚胺基（NHS）酯被证明是用于胺修饰的最佳试剂，因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时，需要考虑的因素很少：1）。溶剂：在大多数情况下，活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中。 2）。反应pH：胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应，包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此，胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。 3）。反应缓冲液：使用胺反应试剂时，必须避免使用含有游离胺（如Tris和甘氨酸）和硫醇化合物的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）也必须在进行染料缀合之前除去（例如通过透析）。 4）。反应温度：大多数缀合在室温下进行。然而，特定标记反应可能需要升高或降低的温度。
存储和处理
收到后，iFluor™染料应储存在<-15 oC，并避免光照和潮湿。 iFluor™染料的重构DMSO储备溶液可以在<-15℃下储存不到两周。 蛋白质缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。 当在2mM叠氮化钠存在下保存并且避光时，缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。 对于更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-60℃下储存，并避光。
染色样本分析
注意：该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™647 SE的缀合物开发的。 您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
操作步骤
1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：
将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL给予1 mL蛋白质标记原液。
注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注3：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳*的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳*，以获得最佳标记结果。
注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到iFluor TM染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B）。 及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。
3.确定最佳染料/蛋白质比例（可选）：
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能不利地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常，对于大多数染料 - 蛋白质缀合物，推荐使用4-6种染料/蛋白质。
3.1使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10％。
3.2运行缀合反应（参见下面的步骤4）。
3.3重复＃3.2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1;分别为15：1和20：1。
3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。
3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比（DOS）（见下页）。
3.6运行上述4种结合物的功能测试，确定最佳的染料/蛋白质比例，以扩大标记反应。
4.运行结合反应：
4.1有效加入适量的染料储备溶液（溶液B）到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中晃动。
注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3，我们建议使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比。
4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
5.纯化缀合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。
5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。
5.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。
5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。 合并含有所需染料 - 蛋白质缀合物的级分。
注1：立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。
注2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥（见下文）。
表征所需的染料 - 蛋白质缀合物
取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。 较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS（例如DOS> 6）的蛋白质也倾向于具有减少的荧光。 根据染料和蛋白质的特性，大多数抗体的最佳DOS建议在2到10之间。 为了有效标记，应将取代度控制为对于1摩尔抗体具有4-10摩尔的iFluor TM 647 SE。 以下步骤用于确定iFluor TM 647 SE标记蛋白的DOS。
1.测量吸收：
为了测量染料 - 蛋白质缀合物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在1-10μM的范围内。
2. 读取280 nm处的OD（吸光度）和染料最大吸收（iFluor™647染料的ƛmax= 649 nm）：对于大多数分光光度计，样品（来自色谱柱部分）需要用去离子水稀释，以便OD 值在0.1至0.9的范围内。 O.D. （280nm处的吸光度）是蛋白质的最大吸收，而649nm是iFluor TM 647 SE的最大吸收。 为了获得准确的DOS，确保缀合物不含非共轭染料。
3. 使用以下等式计算DOS：
[染料]是染料浓度，并且可以根据Bee-Lambert定律容易地计算：A =εdyeCL。 [蛋白质]是蛋白质浓度。 如果共轭效率足够高（优选> 70％）或通过比尔 - 朗伯定律更准确地计算，则该值可以通过重量（加入反应）估算：A =ε蛋白质CL。 例如，IgG的ε值为203,000cm-1M-1。 Pε280= 280nm处的蛋白质摩尔消光系数（例如IgG的摩尔消光系数为203,000cm-1M-1）。 对于iFluor TM 647染料SE，CF（280nm处的染料吸收校正因子）= OD280 / OD649 = 0.03。 250,000 cm-1M-1是iFluor™647 SE的摩尔消光系数。
参考文献
1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York.
2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.
3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking
reagents. Bioconjug Chem 3, 2-13.