中空纤维切向流过滤结合膜层析制备高纯度HSV-2候选疫苗ACAM529
简介
单纯疱疹病毒2型（HSV-2）是溃疡性生殖器疱疹的主要病原，全球每年新增感染达2300万例，其治疗方式主要围绕口服抗病毒治疗，但已有HSV-2候选疫苗进入临床试验，包括灭活、活性衰减、亚单位、DNA及多肽疫苗等，其中，野生型病毒删除UL5和UL29基因构建的复制缺陷型HSV-2疫苗株病毒（dl5-29再衍生，并重命名为ACAM529）被认为是较有效的候选疫苗，在小鼠和豚鼠体内都有效诱导了保护性免疫反应。但传统使用疫苗经离心纯化方法制备，该技术不适用于商业化生产。
临床用病毒疫苗的制备包括上游病毒生产和下游病毒纯化，后者需维持病毒感染性，并清除宿主细胞杂质。已有多种方法用于纯化细胞培养衍生病毒颗粒，本实验使用膜层析结合中空纤维切向流过滤（TFF）制备高纯度、功能性ACAM529疫苗，主要步骤包括使用硫酸葡萄糖（DS）从感染的互补Vero细胞培养中洗提ACAM529、核酸内切酶处理、深层过滤、阴离子交换层析、中空纤维切向流过滤，处理获得的疫苗株病毒纯度较高，且具有良好的免疫源性。
实验
实验使用互补Vero细胞系AV529-19，按已有方法制备ACAM529主病毒种子库。小规模培养生产使用12孔板和T125摇瓶，然后放大至10层NUNC细胞工厂（NCF，工作体积2L，培养面积6320cm2，Thermo Fisher），对培养条件进行优化，以确保ACAM529产率最大化。
实验使用两种方法纯化ACAM529，第一种方法使用平面膜包式切向流过滤结合蔗糖垫层超速离心，具体操作包括从NCF手动刮离感染细胞，离心后加入稳定缓冲液重悬，细胞悬液加入微流机（Microfluidics Corporation）机械破碎细胞并切断细胞基因组DNA，然后加入Benzonase®核酸内切酶(Merck Millipore)处理后，离心澄清。澄清后的细胞裂解液使用配有3个30kD、50cm2聚醚砜板式膜的过滤系统从1100mL浓缩至50mL，过滤过程中，入口压力维持为30psi，背压从1psi上升至8psi，以达到足够的流速。过滤后的回流液使用25%蔗糖垫层超速离心处理4h（50,000×g，4℃），并将获得的ACAM529颗粒重悬于20%蔗糖稳定缓冲液，-80℃储存。
第二种方法使用膜层析结合中空纤维切向流过滤。具体操作时，先倒出NCF中的感染培养基，加入DS洗提缓冲液，孵育后离心澄清，加入Benzonase®反应液，温和搅拌，反应特定时间后，使用0.65μm深层过滤器过滤清除残留的细胞碎片及其它聚集杂质。膜层析使用Mustang® Q滤芯（Pall Corporation），操作前先灭菌、预湿、低盐平衡，上样后用平衡缓冲液漂洗，然后用0.7M NaCl缓冲液洗脱杂质，再用2M NaCl缓冲液洗脱含ACAM529馏分，后者使用KrosFlo®研发用IIi切向流过滤系统（Spectrum Laboratories，产品编号：SYR2-U20-01N；配100kD、85cm2聚砜中空纤维过滤组件）浓缩5-10倍，并进行3-5体积洗滤后换液至20%蔗糖稳定缓冲液。操作过程中，为降低剪切，流速设定为130mL/min（剪切约为4,000 S-1）。洗滤时，跨膜压（TMP）控制为4psi以下，以减缓凝胶层形成。产物于-80℃保存。所有操作在无菌条件下进行，因HSV-2病毒颗粒较大（180-200nm），无法对终产物进行除菌过滤。
产物纯化后，测定ACAM529滴度，并使用ELISA、qPCR及PicoGreen dsDNA分析法检测ACAM529纯度，免疫源性通过小鼠皮下免疫实验进行分析。
结果
使用蔗糖垫层超速离心进行ACAM529实验室规模制备时，每1 X 107 PFU ACAM529中会有2μg以上的宿主细胞DNA残留，而使用本实验方法二时，残留量低于10ng，如以宿主细胞蛋白残留为衡量标准，该方法产物纯度高出200倍，而工艺处理液杂质为衡量标准时，纯度高出2个数量级。
使用机械细胞破碎时，产物中会有较高的dsDNA残留。替代方法是使用DS，从宿主细胞表面有效化学洗提获得ACAM529，并使用Benzonase®核酸内切酶降低产物中的DNA载量。
在比较了一系列层析方法后发现，使用Mustang® Q膜层析滤芯所获得的阶段收率最高，而使用KrosFlo®中空纤维切向流过滤系统替换板式膜过滤系统，可有效使收率加倍，原因可能是开放式流道降低了剪切，而在板式膜设计中增加了用于形成湍流的筛网，虽然筛网在一定程度上可提高流速，降低凝胶层形成，但同时亦增加对样品的剪切力。
如以产物中Vero宿主细胞蛋白（HCP）为衡量标准，ACAM529终产物纯化因子可达250倍，而Vero DNA含量亦低于WHO规定限量。纯化过程中加入的DS、Benzonase®等可分别在深层过滤及膜层析过程中清除。此外，动物免疫实验表明，层析纯化获得的ACAM529具有与蔗糖垫层离心纯化获得的样品一致的免疫源性和保护性。
讨论
ACAM529是一种复制缺陷的预防性候选疫苗，在初步的动物实验中已证明其效力，但为满足进一步的动物及临床实验需要，急需一种可规模放大的下游纯化工艺。本实验使用方法结合DS洗提、Benzonase®处理、深层过滤、膜层析及中空纤维超滤/洗滤，有效提高了疫苗总收率。
实验中发现，流体动力学剪切压力对于感染性病毒滴度的损耗非常关键，所以将封闭流道板式膜TFF及微珠层析更换成开放流道的中空纤维TFF及膜层析，从而在纯化步骤的每个阶段都可获得更高的感染性病毒收率。动物实验中获得的疫苗免疫源性及保护性效力数据，也确认了工艺的可行性。
参考文献：
Mundle, S.T., Hernandez, H., Hamberger, J., et al., High-Purity Preparation of HSV-2 Vaccine Candidate ACAM529 Is Immunogenic and Efficacious InVivo. PLOS ONE, 2013, 8(2):1-10.
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