RNA干扰(RNAi)是一种在真核生物中高度保守的的转录后基因沉默机制，利用双链RNA（dsRNA）高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达。自发现以来，RNAi已迅速成为研究细胞和有机体水平上基因功能、调控和相互作用的强大工具。

1、RNAi的作用机制

外源dsRNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，首先被降解成21-25nt的siRNA。随后siRNA中的反义链参与指导合成RNA诱导的沉默复合体（RISC），再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而干扰靶基因表达的功能。

RNAi机制示意图（Jain R G., et al. Insects, 2020.）

2、RNAi两种常用技术手段

RNAi的应用可以通过两种类型的分子介导：化学合成的双链小干扰RNA (siRNA)或基于载体的短发夹RNA (shRNA)。

①siRNA是化学合成的小分子，导致基因沉默和序列特异性RNA降解的重要中间媒介，具有特殊的结构特征即5'端磷酸基团和3'端羟基，其两条链的3'端各有两个碱基的游离，通过与目标mRNA特异性互补结合降解mRNA。

②shRNA即小发卡或短发卡RNA，是一段具有紧密发卡环的RNA序列，可加工成siRNA，shRNA包括两个短反向重复序列，可以克隆至shRNA表达载体，后通过质粒转染或病毒转导引入细胞，用于沉默靶基因的表达。

siRNA和shRNA结构

(A) siRNAs是短的RNA双链，在3’端有两个碱基的游离;（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成;（C）shRNA构建用于插入表达载体;

siRNA与shRNA两者的共同点是都可以有效沉默或抑制目标基因的表达，但是相比化学合成的siRNA，基于载体的shRNA具有稳定性高、脱靶率低、作用时间长和易导入难转染细胞等优势，是研究者广泛使用的技术。

siRNA和shRNA的异同点

一：多和1 shRNA载体构建

根据提供的高效siRNA靶点和靶基因信息构建多和1 shRNA质粒，将多条shRNA克隆至一个载体中，不仅可用于转染细胞，也可包装成病毒导入宿主。

优劣势：

1) 将多个作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，大大增加目的基因下调表达的概率；

2) 将高效的、作用于多个靶基因的shRNA序列克隆进同一shRNA载体，实现多基因同时下调表达的目的；

3) 无需序列筛选，大大减少工作量；

4) 多种病毒载体相可供选择，实现不同实验目的。

不足之处：无法确定哪一条shRNA的干扰效果更好；

二：mir30-based shRNA质粒构建

与传统shRNA只能在Pol III类型启动子（U6或者H1启动子）下表达不同，miR30-shRNA也可使用Pol II类型启动子驱动表达，包括广谱启动子（如CMV、CAG和EF1a等）、Tet-On诱导调控启动子TRE和组织特异性启动子（如hSyn、TBG和cTnT等），可以启动较大的基因转录，且需要polyA等转录终止信号。根据指定的启动子和提供的shRNA序列将其构建至mir30-based shRNA质粒，实现组织特异性基因沉默。

三：诱导性shRNA质粒构建

包括Cre/loxp，Flp/Frt和Tet on等诱导系统。

以Cre on shRNA为例，该服务是使用FLEX(flip-excision)系统实现shRNA诱导表达。

FLEX是一种非常强大的控制基因表达的方法，它采用2对异质、反向的loxp位点(loxP和lox2272)，经过DNA翻转产生带有不同loxp位点的DNA翻转，防止DNA的进一步翻转，从而实现目标基因不可逆的翻转。采用改良版FLEX，将2对异质、反向的loxp位点置于启动子两边，通过Cre作用决定启动子方向，通过不同荧光蛋白可视化shRNA的表达。