产品描述

本产品适用于多重PCR实验。4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen以热启动多重Taq酶制剂与4×扩增缓冲液为组分配置成预混液。本预混液可快速便捷地用于多重PCR反应，扩增子GC含量25-75%范围内可以有效扩增。具备高均一性、高特异性和高灵敏度的特点，同时严控背景菌。本试剂可兼容30~100对以内不同大小片段的多重扩增，也可用于进行数千重及以上扩增子的捕获。可应用病原微生物检测、环境微生物鉴定、食品安全检测等多个应用场景。

运输与保存方式

冰袋运输。-25 ~ -15℃储存，有效期2年。

实验流程

1. 推荐反应体系：

一轮反应体系

【注】

1上表中DNA量和引物浓度均为推荐用量和浓度，可根据具体实验情况进行调整最适浓度。

2）参考建议：每条引物的浓度可在0.02 μM-0.5 μM范围内进行调整。

3）预混液中已经包含扩增所需要的酶、dNTP、盐离子等，无需额外添加。

二轮反应体系

1. 推荐反应程序：

【注】

1. 退火时间可以根据Panel种类不同，进行适当延长，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;
2. 延伸时间以最长片段为准。延伸时间太长会导致非特异性扩增增多，可通过缩短延伸时间来提高扩增特异性，延伸时间不少于30 sec。 
3. 针对模板含量较低的样本，可通过增加循环数提高扩增产出。
4. Panel引物重数较多时可增加退火时间，调整梯度退火程序，或者根据已有Panel的合适的PCR反应程序进行测试。

1. 循环数推荐：

【注】

上表是基于10 ng gDNA进行的一轮及二轮循环数的推荐；当投入量大于10 ng，二轮的相应的循环数可以减少；当投入量小于10 ng，一，二轮的相应的循环数要相应的增加。

1. 多重扩增引物纯化

一轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化

1) 准备工作：将 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮 PCR 产物中，室温孵育 5 min。

4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重复步骤 5，总计漂洗两次。

7) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过 5min）。

8) 直接加入 11 μL ddH₂O，将 PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。进入下一步反应。

二轮 PCR 产物 0.9×磁珠纯化

1) 准备工作：将 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮 PCR 产物中，室温孵育 5 min。

4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始终置于磁力架中，加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重复步骤 5，总计漂洗两次。

7) 磁珠晾干后，将PCR管从磁力架上取下，加入30 μL Nuclease-free ddH₂O覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀。室温孵育2 min。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。

8）将PCR管短暂离心收集后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清(约5 min)。 小心吸取25 μL上清转移至新的EP管中，继续进行下一步反应。

HB230308