一步法快速克隆试剂盒
产品名称: 一步法快速克隆试剂盒
英文名称: HieffCloneTMPlus One Step Cloning Kit
产品编号: 10911ES25
产品价格: 0
产品产地: Yeasen
品牌商标: Yeasen
更新时间: 2024-12-10T11:18:52
使用范围: null
- 联系人 : 李自转
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- 邮编 : 200030
- 所在区域 : 上海
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HB170426
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit
一步法快速克隆试剂盒
产品信息
产品描述
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品,该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点,可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体在克隆位点进行线性化,并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列,使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp-20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合,在重组酶的催化下,仅需反应20 min即可进行转化,完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆,极大的简化了实验步骤。
试剂盒中 2×Hieff clone Enzyme Premix 预混了重组酶和重组反应所需缓冲液,并添加了独特的重组增强因子,显著提高重组克隆效率,即便使用低效率感受态细胞 (107cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector),重组体系还兼容还兼容常规酶切、PCR反应体系。
该试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分
运输与保存方法
冰袋(wet ice)运输。产品-20 oC保存,有效期1年。
实验流程
实验流程概览
1)线性化克隆载体制备;
2)插入片段扩增引物设计;
3)插入片段PCR扩增;
4)进行重组反应;
5)反应产物转化、涂板;
6)克隆鉴定。
图一 实验流程概览
1. 制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点,并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围之内时,重组效率将达到最大。
线性化载体可通过限制性内切酶酶切(单酶切或双酶切)或反向PCR扩增获得。
A.酶切制备线性化克隆载体
双酶切线性化:线性化完全,转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。
单酶切线性化:线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
【注】:① Hieff CloneTM重组反应体系内无DNA连接酶,不会发生载体自连反应。因此,即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高,应重新制备线性化克隆载体。
② Hieff CloneTM重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书,例如Hind III,65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。
B.反向PCR扩增制备线性化克隆载体
推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase,Cat No. 10135ES) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒,以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此,如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一,扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒,直接使用进行重组反应时,重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此,在进行较大片段(>5kb) 克隆时,我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化,以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
表一:线性化克隆载体的使用方式
【注】:直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时,使用体积不应超过4μL(重组反应总体积的1/5)。
2. 制备PCR产物
2.1设计扩增引物
Hieff CloneTM引物设计总的原则是:通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列,使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp-25 bp)。
正向扩增引物设计方式:
5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’
反向扩增引物设计方式:
3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列;
上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列(用于同源重组)。
以pUC18作为克隆载体为例,引物设计方案如图二所示。
A. 如克隆载体选用双酶切线性化(Hind III + EcoR I):
B. 如克隆载体选用单酶切线性化(BamH I):
(注:克隆完成后插入片段两端都具有完整的BamH I酶切位点)
C.如克隆载体选用PCR扩增制备:
(注:克隆完成后插入片段将与载体无缝拼接)
图二 重组引物设计方案
【注】:如最终引物长度超过40bp,我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化,可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时,只需计算基因特异性扩增序列的Tm值,载体末端同源序列不应参与计算,为了得到高效率克, 隆,建议Tm≥48℃。
2.2 插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增,无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase,Cat No. 10135ES),以减少扩增突变的引入。
PCR结束后,取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此,如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒,且PCR产物电泳条带单一,扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低,直接使用进行重组反应时,重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此,在进行较大片段 (>5 kb) 克隆实验时,我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
表二:扩增产物推荐使用方式
【注】:直接使用扩增产物进行重组反应时,使用体积不应超过4μL(重组反应总体积的1/5)。TUNEology 波长可调检测卡盒-->