神经干细胞移植对缺氧缺血新生大鼠感觉运动机能的影响

资料来源：http://www.bio-will.com/pdlistone/tech/739695.html

【摘要】 目的 研究神经干细胞 (NSCs)移植对改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (H I BD)后感觉运动障碍的作用。

方法  7d龄新生SD大鼠,随机分为假手术组, HIBD组和脑内移植组 ,后两组 H I BD损伤后3 d分别在左侧感觉运动皮质区植入BrdU标记的 NSCs或培养基作为对照 ,观察植入 4周后大鼠感觉运动功能的变化和移植细胞在脑内的存活和分化情况。结果 与 H I BD组比较 ,移植组在 T迷宫和四项感觉运动功能测试中,表现出明显的改善。在T迷宫中,自发改变率(69.23±13.34) % vs (45.00±27.27)%] (P<0.05)上升;在握持牵引试验中 ,握持时间明显延长 [ (49.15±13.39) s vs (27.20±15.18) s ] ( P <0.05) ;在肢体放置和足错误试验中的不对称性消失 ,姿势反射也明显改善 ( P < 0 . 05 )。BrdU间接免疫荧光显示移植后 4周 ,在脑内可见存活的 NSCs分布于移植点附近; BrdU和 NF2 200免疫荧光双标显示移植后4周 NSCs可部分分化为神经元表达 NF2 200。 结论 脑内移植 NSCs对 H I BD新生大鼠的感觉运动机能和行为的恢复有良好的促进作用。

【关键词 】 神经干细胞; 移植; 感觉运动; 缺氧缺血; 大鼠

新生儿缺氧缺血性脑病 (H IE)的病死率高 ,预后差,可产生永久性神经功能障碍。目前对新生儿 H IE的治疗仅局限于支持疗法 ,尚无促进神经再生的手段[ 1 ]。目前 ,在使用神经干细胞 (NSCs)移植治疗缺氧缺血性脑损伤 (H I BD)的动物实验和临床实验中,均已取得了一定的疗效[2]。但是这些研究结果大多来自于成年动物和成年人,NSCs移植能否改善新生大鼠HIBD后的感觉运动障碍尚未见报道。本研究探讨脑内移植胚鼠 NSCs对新生大鼠 H I BD后感觉运动功能的影响。

材料和方法

一、 材料

SD大鼠 (清洁级)。DMEM /F12 ( 1: 1 )、 B27 ( Gibco ) , bFGF、EGF ( Pep r oTech EC)。抗 NF2 200、 抗 B rdU (NeoMarkers)。大鼠脑立体定位仪, T迷宫、 常压缺氧舱均为参照文献自制。

二、 胚胎 NSCs的分离、 培养、 B rdU标记及收集

取孕 14 d S D大鼠的胚胎 ,分离前脑皮质组织 ,胰酶消化吹打制成单细胞悬液后接种于含 10 ng/mlbFGF和 20 ng/ml EGF的 DMEM /F12培养基 (另含 B2720μl /ml)中培养 ,每 2～3 d半量换液 1次。移植前3 d,将准备移植的 NSCS换液 ,同时在培养基内加入 B r2dU孵育 ,终浓度为 10μmol /L。收集在体外稳定传代培养 1月并经 BrdU标记的 NSCs备移植用。4%台盼蓝染色细胞计数 ,活细胞 > 95% ,调整活细胞密度为 5×104个细胞 /μl,置冰上备用。

三、 实验动物分组

新生7d龄SD大鼠,共35只,随机分为假手术组( Sham, n = 10),HIBD+培基移植对照组 (HIBD, n=12) , H I BD+NSCs移植组 (NSCs,n = 13)。

四、 H I BD模型制作

参照Rice方法[3],7d龄SD新生鼠乙迷麻醉后分离出左颈总动脉并结扎,休息2 h后,将大鼠置于有机玻璃低氧舱内,氧浓度在8%(7%～9%) ,舱内温度控制在(36±2)℃,湿度为70% ±5% ,缺氧时间持续

2 h。实验结束后将大鼠放回鼠笼由母鼠行母乳喂养。

五、 脑内移植

HIBD损伤后3d,低温麻醉后,将动物固定于立体定位仪 ,以左侧感觉运动皮层区(坐标AP:+ 0. 3mm,ML:-2mm, DV:-1.5mm)为移植点 ,使用微量进样器缓慢注入 2μl NSCs细胞悬液或培养基。

六、 大鼠感觉运动功能的检测

42 d龄时测试。参照 Bona[ 4 ]方法,包括4个试验。行为学测试均按盲法进行。

1 .握持牵引试验:大鼠用前爪抓住离桌面45cm水平放置的直径为0.6 cm的空心塑料管悬挂,记录其悬挂的时间(最大值为60 s,超过60s按60s计)和右侧(缺血对侧)后肢能否放到管子上。

2 .足错误试验:记录大鼠在水平放置的网格上(50cm×40 cm,每格3cm×3cm) 2min内前、后肢或爪子掉下来的次数 ,为排除不同大鼠活动度的差别的影响,只将左右侧错误次数的差值进行统计学分析。

3 .姿势反射试验:抓住大鼠的尾巴 ,使之悬挂于距离桌面 50 cm高处。正常鼠将两个前肢都伸向桌面(0分,而有脑损伤的大鼠损伤大脑半球对侧的肢体呈屈曲状(1分) ,然后将大鼠放在桌上,在肩后的侧面加压直到前肢伸直 ,重复数次 ,如果朝右侧 (损伤大脑半球的对侧 )的抵抗力减弱为异常 (2分)。

4 .肢体放置试验:记录大鼠在 6种不同的感觉刺激下左右侧前后爪的放置情况 ,记录每只鼠两侧得分的差值。计分标准如下: 0分 ,爪子放置正确、 迅速; 1分 ,迟缓或不完全正确; 2分 ,未放置。

七、 T迷宫自发交替及强迫改变

参照 Balduini[ 5 ]方法。

1 . T迷宫自发交替:自 28 d龄起检测。检测动物在 T迷宫内连续测试中进入不同臂的趋势。每只动物连续测试 3 d,每日 1次 ,每次给两次改变方向的机会,结果分别记录为改变率 0% , 50% ,或 100% ,同时记录进入左右臂的次数。

2 . T迷宫强迫改变:自32d龄起检测。测试分为两个阶段,预测试和测试。预测试时,动物被迫只能进入开放的臂内,并将食物吃完 ,然后将之放入起始臂内,关15 s后撤去所有的闸门开始测试。如果动物进入预测试时未进入的臂内 ,记录为正确;如果进入预测试时已进入的臂内 ,记录为错误。每只动物每日测试5次 ,每次间隔 15min,连续 4 d,共 20次。

八、 免疫荧光染色

根据使用说明书进行 nestine、 BrdU和 NF2 200单染或双染操作。

九、 统计学分析

计量数据以x±s表示,数据均用SPSS11.0统计软件包进行统计。

结 果

一、 NSCs的生长情况及鉴定

原代培养细胞24 h内就可以形成由2～3个细胞组成的小细胞团,即原代克隆,7d时生长为数十个细胞到数百个细胞的克隆 ,悬浮生长 ,呈球形。传代后出现与原代培养相同的大量次代克隆,5～7d可再次传代。间接免疫荧光细胞化学染色发现,NSCs标记蛋白nestin在各级克隆中都有表达。

二、 神经功能评价

1 . T迷宫自发交替试验:HIBD组的大鼠选择左侧(缺血侧) >右侧,差异有显著性意义(P< 0.05)。21T迷宫强迫改变:随天数的增加,Sham组与NSCs组的正确率日渐增加,而HIBD组的正确率上升不明显 ,说明学习能力较差。NSCs组的正确率较HIBD组有明显增高 ,差异有显著性意义 ( P < 0 . 05)。3 .感觉运动功能测试: NSCs组的握持牵引时间较HIBD组延长( P<0.05)。足错误试验中, NSCs组的足错误次数右2左差值较HIBD组减少(P<0.05)。在姿势反射测试中,NSCs组的正常率较HIBD组明显增加(P< 0.05)。在肢体放置试验中,NSCs组右-左的得分较HIBD组明显减少(P<0.05)。41NSCs移植后检