非酒精性脂肪肝 (NAFLD)的特征为肝脏中脂滴沉积，但无明显的酒精摄入和继发性原因，现已被定义为代谢功能障碍相关的脂肪性肝病 (MAFLD)。MAFLD目前包括肝脂肪变性 (HS) 和非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，最终导致肝纤维化和肝硬化。MAFLD发病机制复杂，且与代谢综合征、肥胖和 2 型糖尿病 (T2D) 密切相关。来自英国诺丁汉大学的科研团队通过对MAFLD患者进行多组学分析，获得了不同程度HS患者的特征，并通过综合分析破译了早期MAFLD的发病机制，相关成果发表于《Advanced Science》。
HS与临床指标✦
纳入56名患有不同程度HS的超重和肥胖受试者(BMI>28.8kg·m-2)，排除携带PNPLA3 I148M (I148M为纯合子)的患者。将受试者分为四个不同组：i) 10名无脂肪变性 (HS<5.5%)，ii) 14名轻度脂肪变性 (5.5%≤HS<8%)，iii) 20名中度脂肪变性 (8.0%≤HS<16.5%)，和iv) 12名重度脂肪变性 (HS≥16.5%)。通过测量临床指标对这些受试者进行表型分析。结果显示，与无脂肪变性的受试者相比，重度和中度脂肪变性受试者的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿酸（尿酸盐）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）水平显著升高，这些变量在轻度脂肪变性受试者中也呈现升高趋势。同时发现，与无脂肪变性的受试者相比，重度脂肪变性受试者的临床变量（包括白蛋白、肌酐、肌酸激酶等）显著升高，且在轻度、中度受试者中也呈现升高趋势。基于上述临床变量的主成分分析（PCA）结果显示，无、轻度、中度和重度脂肪变性之间呈现明显的分离趋势。
▲图1. HS与临床和物理变量之间的关系
MAFLD患者肠道和口腔菌群失调✦
对唾液和粪便样本进行宏基因组分析，获得轻度、中度及重度脂肪酸变性组与无脂肪变性组间的口腔及肠道差异物种，并通过每个HS组与无脂肪变性组之间的Log2倍数变化 (Log2FC)对不同HS组间发生显著变化的物种进行线性回归分析。结果显示，肠道菌群中的差异物种变化在轻度和中度脂肪变性组之间以及在中度和重度脂肪变性组之间呈现正相关，而在轻度和重度脂肪变性组之间呈现负相关，提示当发展到重度脂肪变性阶段时，肠道菌群组成存在较大差异。而口腔菌群中差异的物种在不同组之间均呈现正相关，表明不同组之间口腔菌群组成的变化相似。
基于肠道菌群差异分析结果表明，与无脂肪变性组相比，轻度脂肪变性组中Bacteroidetes、Proteobacteria、lenisphaela和Firmicutes4个门水平下的一些物种丰度显著降低；，而中度脂肪变性组中Firmicutes和Bacteroidetes2个门水平的物种丰度显著升高，只有Firmicutes bacterium CAG 95丰度显著降低；重度脂肪变性组中Actinobacteria、Bacteroidetes、Lentisphaerae、Firmicutes和Proteobacteria这几个门水平的物种丰度显著降低；中度和重度脂肪变性组的Firmicutes bacterium CAG 95的丰度均显著降低。
基于口腔菌群差异分析结果表明，与无脂肪变性组相比，轻度组中Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria这几个门水平的一些物种丰度显著降低；中度组中Firmicutes中的一些物种丰度升高，Proteobacteria中的一些物种丰度降低；重度脂肪变性组中Bacteroidetes和Proteobacteria中的一些物种丰度显著降低，而Actinobacteria中的一些物种丰度显著升高；中度和重度脂肪变性组中Haemophilus sputorum的丰度显著降低。
随着脂肪变性越来越严重，肠道菌群组成中Bacteroidia是富集程度最高的菌群，Clostridia是富集程度排名第二的菌群。与无脂肪变性组相比，重度脂肪变性组中Clostridia/Bacteroidia比值显著降低，Firmicutes和Negativicutes的相对丰度降低， Negativicutes的丰度升高。
▲图2. MAFLD患者肠道和口腔菌群失调
宏基因组数据与临床指标关联分析✦
在中度和重度脂肪变性组中，肠道和口腔菌群的物种丰度与显著改变的临床变量之间的相关性分析显示，存在明显的物种丰度减少和增加的簇。且肠道菌群中Firmicutes丰度与HS、AST、ALT和尿酸水平呈显著负相关。口腔菌群中Campylobacter concisus和Capnocytophaga granulosa的丰度与HS、ALT和AST水平呈负相关，而Eikenella sp NML130454和Actinomyces johnsonii则与以上指标呈正相关，而Haemophilus与HS和ALT水平呈显著负相关。
口腔菌群与肠道菌群的相关性分析结果表明，口腔菌群中Actinomyces sp ICM47的丰度与产丁酸菌Eubacterium rectale和Roseburia faecis呈负相关，而肠道菌群中的 Faecalibacterium prausnitzi和Roseburia gutis的丰度与口腔菌群中Prevotella sp oral taxon 306的丰度呈负相关；肠道菌群中Faecalibacterium prausnitzii的丰度与口腔菌群中Haemophilus parainfluenzae, Neisseria mucosa和Prevotella copri的丰度呈正相关。
▲图3. 宏基因组学数据与临床参数关联分析
MAFLD患者血浆代谢组学变化✦
对56名受试者的血浆样本进行非靶向代谢组学分析，共获得928种代谢物，且与无脂肪变性组相比，轻度、中度和重度脂肪变性组中分别有43、79和129种代谢物存在显著差异。在这些代谢物中，分别有17、52和66种与脂质代谢有关，剩余26、27和63种代谢物与其他代谢通路有关（如氨基酸、NAD+和抗氧化代谢）。在这些非脂质代谢物中，分别有16种、14种、43种代谢物存在特异性显著差异。
同时发现，与无脂肪变性相比，血红素的血浆水平仅在轻度脂肪变性组中显著升高，据报道血红素合成的改变可能与MAFLD的氧化应激增加有关。还发现胆红素的降解产物在重度脂肪变性组中显著降低；可促进炎症的N-乙酰犬尿氨酸仅在轻度组升高。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成的前体—喹啉酸，仅在中度脂肪变性组中显著降低。据报道，喹啉酸的下调与动物的MAFLD有关，而NAD+的代谢改变与人类的MAFLD有关。还发现N，N，N-三甲基-5-氨基戊酸盐（TMAVA）在中度脂肪变性组中显著升高在组，而丝氨酸、N-乙酰甘氨酸及甘氨酸结合代谢物的水平仅在重度脂肪变性组中显著降低。所有胆红素降解产物仅在重度脂肪变性组中显著降低。已报道重度脂肪变性组中胆红素可以起到抗氧化剂的作用，减少HS的积累。另一方面，色氨酸、赖氨酸和尿酸代谢相关代谢物、尿酸和黄嘌呤在重度脂肪变性组中显著升高；还发现与尿素循环相关的N，N，N-三甲基丙氨酰脯氨酸甜菜碱（TMAP）在重度脂肪变性组中显著升高，这与之前的研究一致，即MAFLD患者的血浆尿酸水平与HS显著相关。无脂肪变性组相比，重度和中度组中半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物（一种谷胱甘肽和半胱氨酸结合物）水平显著降低；三个脂肪变性组的血浆3-羟基异丁酸（3-HIB）、氧化半胱氨酸甘氨酸水平显著升高，5,6-二氢尿嘧啶水平显著降低。
▲图4. MAFLD患者血浆代谢组学变化
血浆代谢物与表型关联分析✦
对五个临床指标（包括肝脏脂肪、尿酸、ALT、AST和GGT）的血浆水平与代谢物血浆水平进行相关性分析， 结果表明，这些临床变量与TMAP和BCAA及其结合物（包括亮氨酸、异亮氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰异亮氨酸、γ-谷氨酰缬氨酸、3-甲基-2-氧代戊酸和N-乙酰肌肽）的血浆水平呈正相关。ALT、AST和GGT水平与血浆犬尿氨酸水平呈正相关。此外，血浆尿酸水平与这五个临床指标呈显著正相关；而血浆半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物水平与这五个临床指标呈显著负相关。血浆17α-羟基孕烯醇酮3-硫酸盐和5α-孕烯醇酮-3β，20α-单硫酸二醇水平与HS、ALT、AST和GGT水平呈显著负相关。血浆代谢水平差异可用于提示HS，以及MAFLD患者的治疗效果。
MAFLD患者血浆的炎症蛋白质组学变化✦
通过蛋白质组分析平台邻位延伸分析（PEA）测量炎症蛋白标记物的血浆水平。结果显示，与非脂肪变性组相比，CDCP1的血浆水平在轻度脂肪变性组显著降低，在重度脂肪变性组显著升高，而其他大多数蛋白质在所有脂肪变性组中的变化趋势一致。且TNFRSF9血浆水平在三个脂肪变性组均显著降低；ST1A1、IFN-γ和CCL23水平仅在轻度脂肪变性组降低。CX3CL1、TNF、CD40、CSF-1和TWEAK水平在中度脂肪变性组中降低；NT-3、CCL20、CCL4、CCL3、LIF-R、OPG和HGF仅在重度脂肪变性组中升高，而SCF仅在重度脂肪变性组中降低。然后对五个临床指标与炎症相关蛋白血浆水平的进行相关性分析，确定了两个主要簇，这些临床指标分别与第一和第二簇中至少一种炎症相关蛋白呈负相关和正相关。
▲图5. 血浆代谢组与患者表型关系及患者血浆的炎症蛋白质组学变化
基于多组学数据的HS预测✦
通过表型组学、代谢组学、蛋白质组学和口腔/肠道宏基因组学数据分析，确定了在56名受试者中具有区分不同HS程度组间的差异特征。对单组/多组数据进行随机森林算法分析发现与HS相关的关键特征。首先，通过单一组学分析发现，肠道宏基因组数据是预测脂肪变性程度的最佳数据集，准确率> 70%（曲线下面积（AUC）：0.90）。而炎症蛋白质组学数据的预测效能最差，准确率仅为35.3%（AUC：0.72）。接下来，测试了单一组学数据集中的前五或前十个特征，并尝试进行不同组合，结果显示临床指标（五个变量）、代谢组学（十个变量）和蛋白质组学（五个变量）中的各种重要特征产生了64.7%的准确率（AUC:0.92），而添加肠道和口腔宏基因组学（各十个重要特征）后，在预测脂肪变性程度方面的最高准确率为94.1%（AUC:0.951）。并在22名受试者的随访队列中进行验证，通过添加临床指标（五个变量）、代谢组学（十个变量）、蛋白质组学（五个变量）以及肠道和口腔宏基因组学（各十个重要特征）中的重要特征，模型准确率达到82.7%（AUC:0.843）。通过在发现数据集中添加临床、代谢组学、蛋白质组学、肠道宏基因组学和口腔宏基因组学数据中的前五大特征，对HS的预测效能最高（AUC:1.0）。且在随访队列进行了验证获得了更高的预测效能（AUC：0.886）。
临床指标（ALT、AST、uric acid、insulin和 GGT）、代谢组学（N,N-二甲基-5-氨基戊酸、5-（半乳糖基羟基）-L-赖氨酸、酚葡糖苷酸、N,N-二甲基丙氨酸 和 N-甲基牛磺酸）、蛋白质组学（CDCP1、CD244、LIF-R、FGF-21和CXCL9）、肠道宏基因组学（Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena、Prevotella sp CAG 279, Roseburia intestinalis和Ruminococcus bromii）和口腔宏基因组学（Actinomyces naeslundii, Veillonella infantium,Treponema vincentii, Campylobacter showae和Campylobacter concisus）中用于预测HS的前五大特征可被视为MAFLD的候选生物标记物。在本研究中，还发现肠道中的Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena和Ruminococcus bromii和口腔中的Campylobacter concisus和Veillonella infantium的丰度与HS显著相关，且其丰度与血浆代谢物水平和炎症蛋白质组学水平显著相关。
随后生成一个综合多组学网络，用于显示其他组学数据集内和其他组学数据集间的不同分析物之间的关系。对来自上述组学数据的所有分析物之间，通过FDR<0.05的边缘过滤，产生一个具有1032个节点和17536个边（3.3%网络密度）的相对稀疏网络。对网络进行中心性分析发现，前20个连接最多的节点与脂质代谢有关，例如神经酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相关的子通路。同时发现与脂质相关的临床变量是临床变量（总胆固醇、GGT、LDL和TG水平）的最重要节点。
▲图6. 基于多组学数据的HS预测
多组学数据生物网络的综合分析✦
通过Spearman相关性进行综合多组学网络分析以探究多组学数据集内部及数据集之间的重要联系。对网络进行中心性分析发现，前20个连接最多的节点与脂质代谢有关，例如神经酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相关的通路；与脂质相关的临床变量是临床变量的最重要节点。与细胞因子-细胞因子受体相互作用相关的 STAMBP、TNFSF14、SIRT2、CXCL5、CXCL1和CD40，以及与多个信号通路相关的NF-kappa B、TNF 和 IL-17是炎症蛋白质组学中的最重要节点。随后进行聚类分析获得4个簇。在簇-0 中，与氨基酸代谢相关的代谢物位于首位；而簇-1以磷脂、碳水化合物和牛磺酸代谢为主；在簇-2中，包含大多数与脂质相关的代谢物和临床变量，使该簇成为HS中的候选中心变量；簇-3主要与脂肪酸代谢相关。
从多组学随机森林模型中提取特征并仅筛选显著改变的分析物，从而最终获得九种重要特征：ALT、AST、GGT、尿酸、CDCP1、LIF-R、Dorea longicatena (肠道)、Ruminococcus bromii (肠道），Porphyromonas endodontalis（口腔）。通过检索这些特征的第一相邻特征以及HS的子网络，结果表明，其主要集中于脂质代谢物、γ-谷氨酰氨基酸、BCAA 代谢物、脂肪酸代谢（肉碱衍生物）和与HS显著相关的谷胱甘肽相关代谢物。
构建一个以宏基因组学为中心的网络，包括来自随机森林分析的关键特征，以及至少五个样本中丰度>1%的所有菌群物种。与之前的方法类似，结果发现，HS与肠道菌群中的Victivallis vadensis、Firmicutes bacterium CAG 95、Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia以及口腔菌群中Porphyromonas endodontalis和Haemophilus sputorum的丰度呈显著负相关。而肠道中Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia的丰度也与HS、AST和GGT水平呈负相关。肠道中的Streptococcus salivarius的丰度与 ALT、AST 和 GGT 水平呈负相关。另一方面，Dorea longicatena的丰度与ALT和 AST水平呈负相关，与Bacteroidales和Clostridiales呈正相关。总之，多组学数据的综合网络分析强化了单一组学分析的结果，并增加了识别与HS相关的关键特征的能力。此外，它揭示了不同组学数据内部和数据之间的功能关系。
▲图7. 多组学数据生物网络的综合分析
小结✦
本研究通过对不同程度肝脂肪变性（HS）的MAFLD患者进行多组学分析，鉴定出与肝脂肪变性相关的口腔和肠道菌群失调特征，揭示基于全身代谢和炎症过程的宿主-微生物群相互作用。并通过网络分析对多组学数据进行整合，确定HS的关键特征，基于这些特征构建诊断模型，并在随访队列进行验证。
参考文献✦
Multiomics Analysis Reveals the Impact of Microbiota on Host Metabolism in Hepatic Steatosis. Advanced Science. 2022.
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